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May 16, 2023

Identification, isolement et caractérisation structurelle de nouveaux produits de dégradation forcée de l'ertugliflozine à l'aide de techniques analytiques avancées

Rapports scientifiques volume 13,

Scientific Reports volume 13, Numéro d’article: 9472 (2023) Citer cet article

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La recherche élucide le comportement de dégradation du stress de l’ertugliflozine, qui est utilisée pour le traitement des diabétiques de type 2. La dégradation a été effectuée conformément aux lignes directrices de l’ICH et l’ertugliflozine est relativement stable dans des conditions d’hydrolyse thermique, photolytique, neutre et alcaline; Cependant, une dégradation considérable a été détectée dans l’hydrolyse acide et l’hydrolyse oxydative. Les produits de dégradation ont été identifiés par chromatographie liquide à ultra-haute performance-spectrométrie de masse, isolés par chromatographie liquide semi-préparatoire à haute performance, et caractérisation structurale à l’aide de la spectrométrie de masse à haute résolution et de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire. Au total, quatre produits de dégradation ont été identifiés et isolés dans la dégradation acide, qui sont les produits de dégradation 1, 2, 3 et 4. Alors que dans des conditions d’oxydation, le produit de dégradation 5 a été identifié. Les cinq produits de dégradation formés sont nouveaux, ce qui n’a pas été signalé plus tôt. C’est la première fois qu’on documente une caractérisation structurale complète des cinq produits de dégradation à l’aide d’une technique analytique avec trait d’union. La masse à haute résolution et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire ont été utilisées dans la présente étude pour obtenir une confirmation concrète des structures des produits de dégradation. La méthode actuelle est également utilisée pour identifier les produits de dégradation avec une durée de vie plus courte à l’avenir.

Dans les médicaments contre le diabète de type 2, l’ertugliflozine est utilisée comme inhibiteur1,2,3. Il est disponible en tant que médicament solitaire et combiné avec la sitagliptine et la metformine HCl. La littérature disponible sur le marché révèle une certaine validation du développement de techniques analytiques et bioanalytiques, et la stabilité suggérant que des investigations sont accessibles avec le médicament (Ertugliflozine) et le mélange de sitagliptine et de metformine. Le médicament Ertugliflozine (nom de marque Steglatro) est utilisé pour traiter le diabète de type 2. La Food and Drug Administration a autorisé son utilisation en monothérapie et en association à dose fixe avec la sitagliptine ou la metformine aux États-Unis4. Son utilisation en monothérapie ou en association a été approuvée en Europe en mars 2018. L’ertugliflozine appartient à la famille des médicaments appelés gliflozines et est un inhibiteur du SGLT2. Segluromet est vendu en conjonction avec la metformine, et Steglujan est offert en combinaison avec la sitagliptine.

L’ertugliflozine est commercialisée sous le nom de marque Steglatro. Sa formule moléculaire est C22H25ClO7 (Mol. Wt.: 436.13) et le nom chimique est 5-(4-chloro-3-(4-éthoxybenzyl)phényl)-1-(hydroxyméthyl)-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octane-2,3,4-triol. L’ertugliflozine se présente sous forme de sel d’acide pyroglutamique et se présente sous la forme d’une poudre cristalline blanche non hygroscopique. Il est soluble dans l’acétone et l’éthanol, légèrement soluble dans l’acétonitrile et l’acétate d’éthyle, et seulement dans l’eau peu soluble. La figure 1 résume la structure de l’ertugliflozine et de ses produits de dégradation. L’examen de la littérature a révélé peu de publications sur l’analyse de l’ertugliflozine unique et combinée avec la metformine et la sitagliptine. Le développement de la stratégie d’ertugliflozine a été rapporté pour son association avec la metformine RP-HPLC5,6,7,8,9,10,11, avec la sitagliptine12,13,14,15,16,17,18, en association avec la metformine et la sitagliptine19. Plusieurs stratégies bioanalytiques utilisant des approches LC-MS/MS ont été signalées pour détecter la sitagliptine dans le plasma et l’ertugliflozine20,21. Cependant, jusqu’à présent, il n’y avait pas de littérature disponible pour expliquer les produits de dégradation de l’ertugliflozine et leur caractérisation. Aucune documentation ne fournissait la RMN, la spectrométrie de masse à haute résolution et les études IR des produits de dégradation. La présente étude explique la caractérisation structurale détaillée des 5 produits de dégradation de l’ertugliflozine. Par conséquent, la recherche actuelle a été tentée de fournir des preuves concrètes pour les structures des produits de dégradation, ce qui impliquait le développement de la méthode chromatographique de la méthode UHPLC-MS pour ERG et ses 5 produits de dégradation, bien résolus en 4 minutes d’exécution avec des expériences HRMS / MS, IR et RMN (1D, 2D).

Structures de l’ertugliflozine et de ses produits de dégradation.

L’échantillon de cadeau pharmaceutique actif d’ertugliflozine a été obtenu auprès d’organisations pharmaceutiques de premier plan à Hyderabad. Les réactifs et les produits chimiques utilisés pour la recherche étaient l’hydroxyde de sodium, l’acide chlorhydrique, le peroxyde d’hydrogène à 30 % (qualités analytiques), l’acide formique (grade LCMS), l’acétonitrile (grade CLHP), obtenus auprès de Honeywell Research Chemicals, Inde. L’eau utilisée pour l’analyse provenait d’un instrument milli-Q de Millipore, Amsterdam, Pays-Bas. Diméthylsulfoxyde-d6 (grade RMN) de Cambridge Isotope Laboratories, Inc. D, 99,9 % + 0,03 % v/v.

Les instruments d’analyse et les logiciels pris en charge engagés pour le présent travail sont l’instrument UHPLC-MS d’Acquity UHPLC frontend avec un détecteur quadripolaire unique avec le logiciel maslynx 4.2. Instrument HRMS de Thermo avec frontal Dionex ultimate 3000 LC q-exactive orbitrap MS avec source d’ions ESI et logiciel x-calibur. Instrument de purification du module binaire Waters 2545, du détecteur 2489 et de l’échantillonneur automatique 2707 avec logiciel chrom scope-2.1. Instrument RMN de Bruker Avance neo 400 MHz avec logiciel topspin 4.09. Balance analytique de Sartorius-SQP-F, et instrument de spectroscopie infrarouge de Shimadzu ir-afinity-1S et logiciel de solution de laboratoire.

La résolution de chromatographie liquide a été obtenue sur le détecteur de masse quadripolaire unique (SQD2) de Waters fixé avec Acquity UHPLC et détecteur de réseau de diodes photo (PDA) frontal. Double polarité négative et positive avec ESI (ionisation électrospray) source avec eaux Un spectromètre de masse quadripolaire unique a été utilisé pour l’analyse de masse L’optimisation MS a été effectuée en utilisant le mode de balayage de 100 à 1200 Daltons (Da). La température de désolvatation a été maintenue à 350 °C. 700 L h−1 gaz a été réglé pour le débit de désolvatation et celui du gaz conique a été fixé à 60 L h−1. L’instrument de chromatographie liquide-spectromètre de masse a été utilisé à l’aide du gestionnaire d’applications MassLynx 4.1. Les échantillons ont été maintenus à une température de 10 °C et ont été exécutés avec une durée chromatographique plus courte de 4,0 min et un volume d’injection de 0,5 μL.

À la recherche d’une méthode appropriée, fiable et reproductible, différents tampons utilisant différentes colonnes ont été examinés pour optimiser la résolution. Initialement, le développement de la méthode a été effectué en utilisant de l’acide trifluoroacétique, de l’acide formique, des tampons de bicarbonate d’ammonium et différentes colonnes comme le phényle d’acuité, C18 et CSH C18. Au cours d’essais abondants, un tampon d’acide formique à 0,1% avec acquity BEH C18 a montré des résultats positifs et encourageants et les essais restants ont obtenu une résolution ou une résolution médiocre. En outre, des essais approfondis ont été effectués sur une colonne BEH d’acquité avec diverses conditions de débit et de gradient. La séparation optimale de tous les produits de dégradation et de l’API a été obtenue sur la colonne UPLC BEH C18 de Waters Acquity (50 × 2,1 mm, 1,7 μm). La phase mobile comprenait les phases mobiles A et B contenant 0,1 % d’acide formique dans l’eau et 0,1 % d’acide formique dans l’acétonitrile. La séparation a été obtenue à l’aide du programme de gradient Temps (min)/B conc (%) : 0/3, 0,5/3, 2,5/98, 3,5/98, 3,6/03, 4/03 à un débit de 0,4 mL min−1 et à une température de colonne de 35 °C. Un détecteur à photodiodes (PDA) a été utilisé pour surveiller les éluants. Le diluant utilisé dans le rapport de 1:1 (v/v) mélange d’eau et d’acétonitrile. Les 6 pics ont été séparés avec une bonne forme de pic et une bonne résolution dans cet état. La trace finale du développement de la méthode est illustrée à la Fig. 2, et les traces de dégradation sont montrées à la Fig. 3.

Mise au point de méthodes d’ertugliflozine et de ses produits de dégradation dans la colonne BEH C18 d’acquity.

Voie de dégradation de l’ertugliflozine hydrolyse acide (A) et hydrolyse oxydative (B).

Les échantillons ont été analysés à l’aide d’une source ESI équipée de Thermo Q Exactive orbitrap MS; UHPLC Dionex Ultimate 3000 avec détecteur PDA comme frontal. Les paramètres utilisés pour la source de l’instrument étaient la tension de pulvérisation : 3,5 kV; Débit de gaz auxiliaire: 14; Température capillaire: 270 °C; Débit de gaz de balayage: 3; Chauffage au gaz auxiliaire Température: 440 °C. Débit de gaz de gaine: 53. Les données de masse ont été acquises à l’aide du logiciel xcalibur. La réserpine (masse monoisotopique : 608,2734 Da) a été utilisée comme étalon pour vérifier la précision de l’analyseur de masse. Les conditions chromatographiques étaient comme UHPLC-MS. Les données du SGRH pour tous les produits de dégradation sont présentées à la Fig. 4. Les données sur la fragmentation massique obtenues dans le cadre de l’analyse du SGRH-SM pour tous les produits de dégradation sont présentées dans le tableau 1.

Données du SGRH et du SGRH-SM pour l’ertugliflozine et ses produits de dégradation.

Waters semi-préparatif HPLC 2489 double détecteur UV, module de pompe 2545 et gestionnaire d’échantillons 2707 avec collecteur de fraction automatique-III. L’ensemble de l’instrument a été contrôlé avec le logiciel ChromScope-2.1, et le Luna C18 150 × 25 mm et 5 μm emballé en interne a été utilisé pour isoler les produits de dégradation. Toutes les fractions pures isolées ont été lyophilisées à l’aide du lyophilisateur Lyofreeze.

Une dégradation a été observée dans des environnements acides et peroxydés. Pour neutraliser l’échantillon hydrolysé à l’acide, une solution saturée de (NH4)2CO3 a été utilisée, et la solution résultante a été solidifiée par lyophilisation. Après dilution de la solution de peroxyde, évaporée pour obtenir un solide libre. Pour la purification HPLC préparative, l’échantillon identique a été dissous dans une petite quantité de la phase mobile.

Les spectres RMN 1H, 13C et 2D de l’ertugliflozine et des produits de dégradation ont été analysés dans un solvant DMSO-d6 sur l’instrument RMN Bruker Avance Neo 400 MHz équipé d’une sonde d’observation à large bande (BBO) de 5 mm avec système de cale de gradient Z avec des sensibilités de 225:1 et 480:1. Le signal TMS (tétraméthyl silane) à zéro ppm a été utilisé comme référence pour le signal septuor 1H et 39,5 ppm du DMSO-d6 pour le 13C.

Le modèle Shimadzu IR-Afinity-1S avec un logiciel de solutions de laboratoire a été utilisé pour reconnaître les groupes fonctionnels tels que l’alcool, la cétone et la chlorocétone présents dans les composés. Le KBr a été utilisé comme milieu de dispersion pour préparer les granulés de l’échantillon.

Conformément aux lignes directrices de stabilité de l’ICH22,23,24,25,26, divers paramètres de dégradation forcée ont été utilisés, c.-à-d. thermique, oxydation photolytique, neutre, acide et hydrolytique de base. L’étude de dégradation forcée de l’ERG a été réalisée comme mentionné dans les lignes directrices de l’ICH pour l’étude de stabilité. La solution étalon ERG (10 mg mL−1), Un millilitre de solution est transféré dans une fiole jaugée de 10 mL et dilué jusqu’au trait de jauge avec une solution de peroxyde d’hydrogène à 30 %. La solution a été agitée à température ambiante. Un millilitre de la solution a été pris et faire jusqu’à 10 mL avec de l’eau ACN (1:1 v/v). Pour obtenir une concentration finale de 100 μg mL−1, il a été pris pour d’autres études afin d’obtenir le comportement de dégradation. Pour la photodégradation, 25 mg d’échantillon ERG ont été exposés à une lumière UV de 254 nm pendant 48 heures dans une chambre UV. Pour la dégradation thermique, 25 mg d’échantillon d’ERG ont été conservés à 100 °C pendant 48 heures et ils ont été utilisés pour d’autres études afin d’observer le comportement de dégradation.

Pour l’étude d’hydrolyse neutre, acide et basique, une solution mère étalon d’ERG (10 mg mL−1) a été préparée dans de l’ACN et de l’eau (1:1 v/v). 1 mL de solution mère étalon ERG a été transféré dans une fiole jaugée de 10 mL. Ajuster ensuite au trait de jauge en utilisant de l’eau pour la dégradation neutre, 1 N NaOH pour la dégradation alcaline et 1 N HCl pour la dégradation acide (Initialement, la même procédure a été réalisée avec 0,1 N NaOH et 0,1 N HCl. Cependant, aucune dégradation considérable n’a été observée, de sorte que la force de l’acide et de la base a été augmentée à 1 N). La solution a été maintenue sous agitation à une température de 60 °C. Un millilitre de la solution a été prélevé, neutralisé et transféré dans une fiole jaugée de 10 mL. Ensuite, le volume a été maquillé pour marquer avec de l’eau pour obtenir une concentration finale de 100 μg mL−1. Il a été pris pour d’autres études pour obtenir le comportement de dégradation.

Le composé ERG est très stable dans des conditions neutres, d’hydrolyse basique, photolytiques et thermiques et n’a montré aucune dégradation, ce qui confirme la stabilité de l’ERG dans les conditions ci-dessus. Le médicament s’est avéré labile à l’hydrolyse acide et aux conditions de peroxyde. En conséquence, ~ 15–20 % de dégradation a été observée à la fois dans le peroxyde (30 % H2O2 avec agitation à température ambiante, jusqu’à 48 h), l’acide (HCl 1 N avec reflux à une température d’agitation de 60 °C, jusqu’à 48 h) et dans les conditions. Les conditions de dégradation détaillées et les résultats sont présentés dans le tableau 2, et les chromatogrammes de dégradation des conditions d’hydrolyse acide et de peroxyde sont présentés à la Fig. 3. Dans des conditions d’hydrolyse acide, 4 DP ont été formés (DP-1, DP-2, DP-3 et DP-4), tandis qu’en état d’oxydation, un produit de dégradation (DP-5) a été formé. Les structures confirmées de tous les PDD sont révélées à la Fig. 1.

La formation d’impuretés de dégradation était la suivante, pour la formation de DP1, substitution électrophile initiale médiée par l’acide du formaldéhyde protoné à la position ortho comme dans le composé 1 suivie de la chimie de Ritter avec l’acétonitrile donné DP1. Selon la littérature du Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 113 (2015) 621–62927, la fraction sucre dans la molécule cible subit une décomposition progressive pour former du formaldéhyde dans des conditions acides chaudes. Celle-ci en réagissant avec la molécule cible en milieu acide (comme indiqué dans le manuscrit) favorise la formation de 3. Celui-ci réagit à son tour avec l’acétonitrile (utilisé comme solvant à des fins de solubilité) pour former DP-1 par la chimie Ritter.

Formation de DP2, la voie de dégradation proposée pour la formation de DP2 est basée sur la littérature (Chemical Engineering Journal 307, 2017, 877-883)28 dans des conditions acides de Brontted.

Formation de DP3/DP4, selon la littérature du Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 113 (2015) 621–629, la fraction sucre dans la molécule cible subit une décomposition progressive pour former du formaldéhyde/acétaldéhyde et de l’acide acétique dans des proportions différentes29,30. L’acide acétique formé a joué un rôle dans l’estérification du DP2 dans les conditions acides chaudes existantes. De la même manière, le groupe hydroxyméthyle libre subit une chloration via le mécanisme SN2. En conséquence, l’acide protone le groupe hydroxyle et est successivement déplacé par le chlorure pour former le DP4 correspondant.

Formation de DP5, Le mécanisme proposé pour la formation de DP5 est par le clivage oxydatif du groupe aryl éthoxy pour former le phénol correspondant, c’est-à-dire DP5.

À l’aide de la spectrométrie de masse (UHPLC-MS), des échantillons individuels ont été analysés pour déterminer les résultats de toutes les études de stress. Tous les dégradants se sont formés au cours d’un certain temps, et à partir de chaque contrainte, les conditions d’étude sont décrites dans la section expérimentale. Cinq produits de dégradation importants ont été identifiés, isolés et caractérisés par les techniques UHPLC-MS, Prep-HPLC, HRMS, 2D-RMN et FTIR. La plupart de ces produits de dégradation sont formés par le réarrangement du cycle glucidique à six membres de l’API en un cycle furanique à cinq membres.

Les produits de dégradation formant un pourcentage considérable de > 5 % à la suite de la dégradation ont été observés dans des conditions de stress peroxyde et acide. La colonne Luna C18 (150 mm × 25 mm, 5 μm) et l’acétonitrile, acide formique à 0,1% dans l’eau ont été utilisés comme phase mobile pour la purification. Des injections consécutives de solutions d’échantillons brutes ont été injectées, et la collecte des fractions a été effectuée sur la base de la réponse UV et de la masse confirmée ultérieurement par LC-MS. Recueilli séparément fractions de divers produits de dégradation et lyophilisé pour obtenir un solide libre.

Pour obtenir les informations structurelles de l’API Ertugliflozine, toutes les données analytiques ont été enregistrées à des fins de référence. Dans des conditions de mode positif ESI-MS, les ions [M + H]+ et adduit à l’ammoniac [M + H + NH3]+ ont été détectés comme 437,1350 et 454,1617, respectivement, ce qui confirme que la formule moléculaire de l’ertugliflozine est C22H25ClO7. Les données confirmées de l’ertugliflozine sont mentionnées dans le SGRH, le spectre SGHR/SM (Fig. 4, Tableau 1), l’IR (Tableau 4). Le mécanisme provisoire proposé par le SGRH/SM pour les ions de fragmentation protonés de l’ERG est illustré dans les données supplémentaires de la Fig. S1. Le mécanisme structurel proposé pour expliquer le comportement à la dégradation de l’ertugliflozine dans des conditions hydrolytiques et peroxydes acides est illustré à la Fig. 5, et la conformation structurelle de l’ERG à l’aide de la RMN 2D est illustrée dans les Figs. 6 et S2. La conformation structurelle de l’ERG est réalisée par HRMS et 2D-RMN. Tous les autres produits de dégradation sont caractérisés sur la base de la comparaison de ces données d’élucidation structurelle.

Comportement de dégradation proposé de l’ertugliflozine dans des conditions hydrolytiques et peroxydes acides.

Spectres RMN illustratifs pour ERG, DP-1 et DP-2.

Le traitement à l’ertugliflozine avec de l’acide a entraîné la dégradation du produit 1 (DP-1). Ce produit de dégradation a été isolé et sa masse a été confirmée comme [M + H]+ 508,1724 (erreur de − 1,7675 ppm) dans le SGRH pour la formule moléculaire C25H30ClN5O8 illustrée à la Fig. 4. Le spectre du SGRH confirme la présence d’un atome de chlore dans la structure. La structure complète du produit de dégradation a été déterminée par des études RMN et SGRH. L’échantillon a été préparé dans un solvant DMSO-d6 et soumis à une analyse RMN. Expériences d’échange RMN et D2O initialement enregistrées. En comparant les données 1H et D2O, il faut confirmer la présence de cinq protons échangeables dans le composé et dans la région aromatique manquante du motif de cycle 1,4 disubstitué et la présence du motif 1,2,4 trisubstitué. La principale différence par rapport au composé API est la présence d’amide secondaire (H32), de protons de méthylène (H31) et d’un groupe acétyle (H34). En RMN 1H, un total de 30 protons étaient présents, l’amide secondaire est à 8,08 ppm, et les protons aromatiques ont été montrés entre 6,0 et 8,0 ppm. Les protons alcooliques primaires et secondaires sont à 4,5-5,5 ppm, et la résonance des protons aliphatiques entre 1,0 et 4,5 ppm. Les protons de N-méthylène sont à 4,15 ppm et les protons d’acétyle à 1,85 ppm. L’O-méthylène est à 4,00 ppm et les protons de méthylène aromatiques à 3,97 ppm. En RMN 13C, un total de 25 carbones ont été montrés; la majeure partie du carbone en aval est de l’acétamide carbonyle avec 169,26 ppm, suivie du carbone quaternaire attaché au groupe O-éthyle à 154,36 ppm. Les charbons aromatiques restants se situaient entre 100 et 140 ppm, les carbones aliphatiques se situaient entre 10 et 90 ppm. Dans l’expérience HSQC confirmée comme H31 méthylène protons attachés carbones montre à 37,16 ppm, et N-acétyl protons attachés carbone est montré à 22,47 ppm. Dans l’expérience gDQ-CODING, les protons H31 ont montré une corrélation avec le proton H32. Dans l’expérience HSQC 1H-15N, le proton H32 a été confirmé comme un proton NH amidique, et sa valeur d’azote est de 115 ppm. Dans l’expérience HMBC 1H-13C, les protons H31, H32 et H34 ont montré une connectivité au carbone C33, et les protons H31 ont montré une connectivité aux carbones C9, C10 et C11. Toutes les informations clés des données RMN 1D et 2D confirment que le cycle 1,4 disubstitué s’est converti en benzylacétamide. Enfin, il a formé du N-(5-(2-chloro-5-(2,3,4-trihydroxy-1-(hydroxyméthyl)-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octan-5-yl)benzyl)-2-éthoxybenzyl)acétamide et le spectre RMN 2D a été représenté dans les figs. 6 et S3. Les changements chimiques étaient dans le tableau 3 et le mécanisme de dégradation proposé était montré dans la Fig. 5.

De plus, la fréquence d’étirement à 3415 cm-1 dans les spectres FT-IR spécifie la présence de groupes NH et OH, et une fréquence d’étirement de 1645 cm-1 dirige la présence de groupes céto amides. La fréquence d’étirement à 811 cm−1 conduit à l’existence du groupe C–Cl. Un spectre FT-IR significatif a établi l’existence de groupes fonctionnels céto, amide, alcool et chlorure, comme présenté dans le tableau 4. Pour DP-1, le spectre HRMS/MS et le mécanisme provisoire proposé pour les ions de fragmentation protonés ont été présentés dans les figures. 4 et S1.

Le composé DP-2 a été formé par hydrolyse acide du composé ERG. Pour acquérir des informations structurelles, une analyse du SGRH DP-2 a été effectuée et 371,1037 [M + H]+ a été obtenu en tant que molécule protonée avec une erreur de − 2,0463 ppm pour la formule moléculaire calculée C21H19ClO4 illustrée à la Fig. 4. Le spectre du SGRH confirme la présence d’un atome de chlore dans la structure, et la masse du produit de dégradation est inférieure de 66 unités à celle de l’ertugliflozine mère. Pour obtenir la structure méticuleuse du produit de dégradation, des expériences RMN 1D et 2D ont été réalisées. Les données RMN 1H du DP-2 ont montré des différences extrêmes par rapport au composé API. Ici, nous ne pouvions pas voir les protons de l’anneau bicyclique et avons remarqué le proton d’alcool primaire à 5,56 ppm comme un triplet, il a été échangé en échange D2O. Les protons de méthylène apparaissent sous forme de doublet à 4,51 ppm, les protons du cycle furane à 6,59 et 7,28 ppm avec une valeur J de 3,2 Hz. Dans le cycle disubstitué de la région aromatique 1,4, des protons trisubstitués de 1,2,4 étaient présents comme le composé parent à 6–8 ppm, et dans les protons O-éthoxy de la région aliphatique, les protons de méthylène ont été montrés entre 1,0 et 4,5 ppm région. En RMN 13C, un total de 19 carbones ont été montrés en raison de la symétrie C9-C13 et C10-C12 montrant chacun comme un seul signal. La majeure partie du carbone en aval est une cétone, et elle résonne à 180,11 ppm. Les carbones quaternaires du cycle furane sont de 150,15, 161,7 ppm, et le carbone aryle lié à l’O-éthoxy est de 157,05 ppm; Les carbones aryles restants sont de 110 à 140 ppm. Dans la région aliphatique, 4 carbones ont été montrés, le carbone clé du méthylène est à 55,94 ppm, par l’expérience HSQC a confirmé la même chose. D’autres informations clés de l’expérience HSQC sont l’identification des carbones protonés du cycle furane. De l’expérience CODOSI, le proton d’alcool primaire H26 a montré une corrélation avec les protons de méthylène H25, et les protons du cycle furane H21, H22 sont en corrélation les uns avec les autres. De l’expérience g-HMBC confirme les protons H25 montrant la connectivité aux carbones C22 et C23 et H1, les protons H3 montrent la connectivité au carbone C18. Sur la base de la RMN, les données ont conclu que l’anneau bicyclique a été réarrangé et a formé 2,5 anneaux de furannes substitués comme structure représentée dans les figures. 6 et S4 et formé (4-chloro-3-(4-éthoxybenzyl)phényl)(5-(hydroxyméthyl)furane-2-yl)méthanone. Les changements chimiques étaient dans le tableau 3 et le mécanisme de dégradation proposé était montré à la Fig. 5.

De plus, la fréquence d’étirement à 3481 cm-1 dans les spectres FTIR confirme la présence de groupes OH, et la fréquence d’étirement de 1637 cm-1 spécifie la présence de groupes céto. La fréquence d’étirement à 756 cm−1 dirige la présence du groupe C–Cl. Les fréquences significatives FT-IR ont établi l’existence de groupes fonctionnels alcool, céto et chloro, comme le montre le tableau 4. Pour DP-2, le spectre HRMS/MS et le mécanisme provisoire proposé pour les ions de fragmentation protonés ont été présentés dans les figures. 4 et S1.

L’hydrolyse acide du composé ERG a abouti au composé DP-3. Pour acquérir des information_ structurales de DP-3, une analyse HRMS a été exécutée et a observé la molécule protonée [M + H] + comme 413,1139 avec une erreur de − 2,8246 ppm, ce qui confirme la formule moléculaire calculée C23H21ClO5 illustrée à la Fig. 4. La masse du produit de dégradation a moins de 24 unités que celle de l’ERG, et de connaître la structure exacte. De plus, des expériences RMN ont été enregistrées. La RMN du composé DP-3 1D est presque comme la DP-2, observée peu de différence, au lieu du proton alcoolique vu groupe acétyle. En RMN 1H, un nombre total de 21 protons sont présents, avec ces 9 protons de la région aromatique et les protons du cycle furane montrés à 6,79 et 7,32 ppm avec J = 3,6Hz. Région aliphatique, un nombre total de 12 protons étaient présents, en ce sens que 3 groupes méthylène montrent entre 3,5 et 5,5 ppm, et les protons du groupe acétyle ont montré à 2,07 ppm. Dans la RMN 13C, le nombre de carbones est de 21, dans ces 16 carbones de la région aromatique et 5 carbones de la région aliphatique. Le carbone le plus en aval est la cétone à 180,22 ppm, suivie de l’O-acétyle à 169,86 ppm et du carbone aryle attaché à l’O-éthoxy à 157,05 ppm. Les carbones quaternaires du cycle furane sont à 150,92 et 154,92 ppm, les carbones protonés sont à 122,12 et 112,85 ppm, les carbones restants ont été montrés entre 110 et 140 ppm, les carbones aliphatiques ont été montrés à 10-65 ppm. Pour identifier les carbones protonés à partir du nombre total de carbones, une expérience HSQC a été menée et confirme que les carbones O-méthylène C25 est de 57,47 ppm et C15 est de 62,86 ppm et les carbones protonés du cycle furane étaient à 122,12 et 112,85 ppm. Dans l’expérience COSY H21, les protons H22 montrent des corrélations. Pour vérifier les corrélations 2J et 3J, l’expérience HMBC composée DP-3 a beaucoup aidé, ici les corrélations clés étaient H25, les protons H28 montrent une connectivité au carbone C27, H25 a montré la connectivité au carbone C22, C23 également et H1, les protons H3 montrant la connectivité au carbone C18 ainsi que ces connectivités restantes s’adaptent à la structure. La structure du produit de dégradation 3 était l’acétate de (5-(4-chloro-3-(4-éthoxybenzyl)benzoyl)furane-2-yl)méthyle, et le spectre RMN 2D était représenté dans les figures. 7 et S5. Les changements chimiques étaient dans le tableau 3 et le mécanisme de dégradation proposé était montré dans la Fig. 5.

Spectres RMN illustratifs pour DP-3, DP-4 et DP-5.

Une confirmation supplémentaire effectuée avec FT-IR et une fréquence d’étirement de 1744 et 1645 cm-1 indique la présence de groupes céto, et des signaux à 1349, 1039 cm-1 confirment la présence de groupes C-O. Aucun signal dans la région de 3400–3000 cm−1 ne confirme que les protons OH et NH ne sont pas présents dans la structure. La fréquence d’étirement à 756 cm−1 dirige la présence du groupe C–Cl. Un spectre FT-IR significatif a confirmé la présence de groupes fonctionnels céto et chloro, comme indiqué dans le tableau 4. Pour DP-3, le spectre HRMS/MS et le mécanisme provisoire proposé pour les ions de fragmentation protonés sont présentés aux Figs. 4 et S1.

Le DP-4 a entraîné un traitement ERG avec de l’acide. Après l’isolement, le SGRH a été enregistré pour connaître sa masse. Pour les informations structurelles de DP-4, une analyse HRMS a été effectuée et a obtenu la molécule protonée [M + H] + 389,0694 avec une erreur de − 2,9529 ppm pour la formule moléculaire C21H18Cl2O3 illustrée à la Fig. 4 et le spectre HRMS ayant le motif dichloro qui conforme le composé ayant deux atomes de chlore. Il a 48 unités de moins par rapport au composé ERG parent. Les études RMN ont déduit la structure précise du DP-4. L’échantillon a été préparé dans un solvant DMSO-d6 et les analyses RMN 1D et 2D requises ont été effectuées pour déterminer la structure du DP-4. Dans les données RMN 1H montre 18 protons, et une différence mineure a été observée entre les données RMN 1H de DP-2 et DP-4, c’est-à-dire manquant du proton alcoolique, dans DP-4, H25 méthylène apparaît comme un singulet à 4,93 ppm. Les protons du cycle furane ont été montrés à 6,82 et 7,31 ppm avec J = 3,6 Hz. Deux doublets forts H9, H13 et H10, H12 montrent à 7,15, 6,86 ppm, H1, H2 et H3 protons sont entre 7,5 et 7,9 ppm, et les protons aliphatiques montrent entre 1 et 5 ppm. En RMN 13C, le nombre de carbones est de 19, en raison de la nature symétrique dans un anneau 1,4-disubstitué au lieu de 6 signaux 4 observés. La majeure partie du carbone en aval est la cétone résonne à 180,21 ppm, le reste des carbones montrant à 110-160 ppm. Dans la région aliphatique, quatre carbones ont été montrés, le carbone clé du méthylène à C25 est à 36,88 ppm, les carbones O-éthoxy sont à 14,63 et 62,86 ppm, le carbone méthylène C7 est à 37,37 ppm. Par l’expérience HSQC validé les carbones protonés, les décalages de carbone protonés du cycle furane montrant à 122,26 et 112,62 ppm. Dans les expériences HMBC observées, deux connectivités importantes dans ce proton H25 montrant une corrélation 2J avec le carbone C23 et une corrélation 3J avec le carbone C22. La deuxième connectivité importante est H1, H3 protons montrant la connectivité C18 carbone. Toutes les informations importantes des données RMN confirment que le cycle bicyclique a été réarrangé et que 1,5 cycle furane substitué a été formé. En conséquence, la structure formant le (4-chloro-3-(4-éthoxybenzyl)phényl)(5-(chlorométhyl)furan-2-yl)méthanone et le spectre RMN 2D a été représentée dans les figs. 7 et S6. Les changements chimiques étaient dans le tableau 3 et le mécanisme de dégradation proposé était montré dans la Fig. 5.

Le spectre FTIR indique la présence du signal 1649 cm−1 indique la présence du groupe céto, et les signaux à 1305 et 1246 cm−1 indiquent la présence de groupes C–O. La fréquence d’étirement à 841 703 cm−1 dirige la présence du groupe C–Cl. Aucun seul dans la région de 3400–3000 cm−1 ne confirme que les protons OH et NH ne sont pas présents dans la structure. Les signaux FT-IR dans le spectre sont conformes à la structure comprend des groupes fonctionnels chloro et céto, comme indiqué dans le tableau 4. Pour DP-4, le spectre HRMS/MS et le mécanisme provisoire proposé pour les ions de fragmentation protonés sont illustrés aux Figs. 4 et S1.

Le produit de dégradation 5 a été formé en traitant le composé API avec du peroxyde d’hydrogène. Pour les informations structurelles DP-5, une analyse HRMS a été effectuée et a observé la molécule protonée [M + H]+ de 409,1037 avec une erreur de − 2,9086 ppm pour la formule moléculaire C20H21ClO7 illustrée à la Fig. 4. D’après les données de masse, il est entendu que 28 unités étaient inférieures au composé API parent et avaient un atome de chlore dans la structure. Les études RMN ont fait la caractérisation complète du DP-5. Nous avons enregistré des expériences RMN obligatoires pour un échantillon dissous dans DMSO-d6. Expériences primaires de RMN 1H et D2O disant que, dans les données RMN 1H montrant 21 protons, dans l’expérience d’échange D2O 5 protons ont été échangés et montrant 16 protons. D’où la présence de cinq protons labiles dans le composé. La principale différence entre le composé DP-5 et le composé parent est l’absence du groupe O-éthoxy et la présence de protons phénoliques OH à 9,24 ppm; Les 4 protons labiles restants montrent entre 4,5 et 5,5 ppm (1° et 2° alcooliques). Dans la région aromatique, les protons du cycle 1,4 disubstitués sont à 6,66 et 6,97 ppm, les protons du cycle chloro substitués sont à 7,1–7,5 ppm, les protons aliphatiques de méthine et de méthylène montrent entre 3 et 4 ppm. Dans la RMN 13C, 7 carbones apparaissaient dans la région aliphatique et 11 signaux dans la région aromatique. Plus de carbone déblindant est phénolique OH situé carbone quaternaire, reste des signaux aromatiques ont été montrés entre 100 et 140 ppm. Dans la région aliphatique, le méthylène et le carbone méthinique attachés à l’O se situaient entre 55 et 90 ppm, les carbones de méthylène aromatiques étaient à 37,70 ppm. dans l’expérience HSQC a confirmé les changements des carbones de méthylène et de méthine. Dans l’expérience COSY, le proton H24 a montré une connectivité avec H19, H23 montre avec H20, le proton H22 est avec le proton H21 et H28 montre une corrélation avec les protons H25. Ces connectivités sont aidées à identifier les protons de méthine et de méthylène. Dans l’expérience HMBC, peu de corrélations 3J importantes sont observées H1, H3 et H27 protons montrant une connectivité au carbone C16. En outre, les protons H7 montrant une connectivité 3J à C3, C5 et C9, C13; Connectivité 2J aux carbones C4, C8. Les données RMN et de masse ont confirmé que le groupe éthoxy s’est détaché du groupe parent et a formé un OH phénolique sur un cycle 1,4 disubstitué. La structure du DP-5 a été élucidée et le spectre RMN décrit dans les Figs. 7 et S7. Les changements chimiques étaient dans le tableau 3 et le mécanisme de dégradation proposé était montré dans la Fig. 5. L’analyse FT-IR confirme également la présence du groupe OH à une fréquence d’étirement de 3443 cm−1. La fréquence d’étirement à 755 cm−1 dirige la présence du groupe C–Cl. Aucun signal dans la région de 1750–1600 cm−1 ne confirme l’absence du groupe céto dans la structure. Les fréquences centrales ont établi la présence d’alcool, de groupes fonctionnels de chlorure, et les données sont présentées au tableau 4. Pour DP-5, le spectre HRMS/MS et le mécanisme provisoire proposé pour les ions de fragmentation protonés sont saisis dans les figures. 4 et S1.

L’étude de dégradation de l’ertugliflozine dans des conditions de stress a été examinée conformément aux lignes directrices de l’ICH. L’IPA a été soumis à des conditions de dégradation oxydative, acide, alcaline, neutre, photolytique et thermolytique. Le médicament était stable dans des conditions basiques, neutres, thermiques et photolytiques, et aucun produit de dégradation n’a été observé. Cependant, cinq produits de dégradation se sont formés dans des conditions d’hydrolyse du stress acide et oxydatif. Ces dégradants sont développés en raison du réarrangement du cycle, qui est labile à l’hydrolyse acide (DP-1, DP-2, DP-3 et DP-4), et DP-5 a été formé en éliminant le groupe éthyle en présence de peroxyde. Tous les produits de dégradation ont été séparés et caractérisés entièrement à l’aide de diverses techniques analytiques telles que la RMN (expériences 1D et 2D) et les expériences HRMS/MS. Les données FT-IR ont fourni un complément supplémentaire pour confirmer les structures. Les cinq PDD sont des produits nouveaux et ne sont rapportés dans aucune littérature. La présente étude fournit l’interprétation structurale complète de l’ertugliflozine et des 5 produits de dégradation à l’aide d’études HRMS, FTIR et RMN 2D. Il rapporte également une méthode UHPLC-MS bien développée pour séparer tous les produits de dégradation avec une bonne résolution.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers de renseignements supplémentaires.

Ertugliflozine

Ingrédient pharmaceutique actif

Conseil international pour l’harmonisation

Cotransporteur sodium-glucose 2

Chromatographie liquide ultra-haute performance-spectrométrie de masse

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

Spectrométrie de masse à haute résolution

Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire bidimensionnelle

Détecteur quadripolaire unique

Détecteur à matrice de photodiodes

Ionisation par électropulvérisation

Spectroscopie corrélée filtrée quantique double gradient

Spectroscopie de cohérence quantique unique hétéronucléaire à gradient

Spectroscopie de cohérence à liaisons multiples hétéronucléaires à gradient

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Sincères remerciements à Aragen Life Sciences Pvt. Ltd. Management et GITAM management pour leur soutien et la fourniture du laboratoire pour effectuer cette recherche.

Analytical Discovery Chemistry, Aragen Life Sciences Pvt. Ltd., IDA Nacharam, Hyderabad, 500076, Inde

Suresh Salakolusu, Muralidharan Kaliyaperumal, Umamaheshwar Puppala et Mahesh Ranga

Département de chimie, GITAM School of Science, GITAM Réputé être une université, Visakhapatnam, 530045, Andhra Pradesh, Inde

Suresh Salakolusu & Ganapavarapu Veera Raghava Sharma

Département de chimie, GITAM School of Science, GITAM Deemed to be University, Hyderabad, 502329, Telangana, Inde

Naresh Kumar Katari

École de chimie et de physique, Collège d’agriculture, d’ingénierie et des sciences, Westville Campus, Université du KwaZulu-Natal, P Bag X 54001, Durban, 4000, Afrique du Sud

Naresh Kumar Katari & Sreekantha Babu Jonnalagadda

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S.S. a effectué toutes les analyses expérimentales de ce document de recherche, y compris la purification et l’analyse HRMS. N.K.K. a participé à la conception de l’ouvrage, a effectué l’analyse statistique, a rédigé le manuscrit et a supervisé.G.V.R.S. a contribué à l’analyse théorique et a aidé à comparer les résultats des tests théoriques et expérimentaux. M.K. a aidé à la collecte de littérature et à l’exécution du travail. U.P. a participé à l’interprétation des produits de dégradation. M.R. a été pris en charge pour l’analyse RMN des produits de dégradation. S.B. Jonnalagadda a été révisé et édité le manuscrit. Nous autorisons la publication de l’article sans aucun conflit.

Correspondance avec Naresh Kumar Katari ou Ganapavarapu Veera Raghava Sharma.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Salakolusu, S., Katari, N.K., Sharma, G.V.R. et al. Identification, isolement et caractérisation structurale de nouveaux produits de dégradation forcée de l’ertugliflozine à l’aide de techniques analytiques avancées. Sci Rep 13, 9472 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36289-9

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Reçu: 15 janvier 2023

Acceptée: 31 mai 2023

Publication : 10 juin 2023

DEUX : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36289-9

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